多肽合成中氨基酸的消旋問題

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多肽鍵生成中的外消旋化一直是多肽化學中困擾化學工作者的一個主要難題,也是多肽化學研究的熱點之一。肽鍵的形成需要將羧酸活化,活化后的羧酸中間體,以及后續的縮合過程都有可能導致外消旋化。深入研究發現,這種外消旋化有兩種機制[1]。第一種機制是直接消旋化——從α碳直接攫取氫質子(Path A);第二種機制經歷惡唑環的過程——惡唑環的α氫質子被攫。Path B)。

Figure 1 外消旋機制:(A)直接消旋;(B)經惡唑環消旋

 影響肽鍵外消旋化的因素主要有以下幾個:(1)堿的因素;(2)添加劑因素;3)縮合劑的因素;4)其他因素。本文擬對上述因素進行簡單的總結。

1)堿的因素
Table 1氨基酸N-羧酸酐(NCA)衍生物的消旋速率[2]
注:4-MM4-甲基嗎啉;4-EM4-乙基嗎啉

Carpino等人在上世紀九十年代就發現,有機堿的堿性和立體位阻對外消旋有很大的影響[3]。多肽縮合反應中使用最為廣泛的有機堿是:N,N-二異丙基乙胺(DIEA),N-甲基嗎啡啉(NMM)和2,4,6-三甲基吡啶TMP,Collidine)。其中,N,N-二異丙基乙胺堿性較強(pKa 10.1),N-甲基嗎啡啉(pKa 7.38)和2,4,6-三甲基吡啶(pKa 7.43)較弱。由于2,4,6-三甲基吡啶(TMP,Collidine)的立體位阻更大,因此在很多肽鍵形成中,使用2,4,6-三甲基吡啶(TMP)產生的消旋產物更少。另外,平時常用的三乙胺由于其位阻較小堿性較強,外消旋速率比N,N-二異丙基乙胺和N-甲基嗎啡啉都要更快(Table 1[2]。Table 2展示了氨基酸的N-羧酸酐衍生物與不同的有機堿消旋化之后再與芐胺縮合的結果[2]。該結果顯示2,4,6-三甲基吡啶(TMP,Collidine)產生的消旋產物最少。

Table 2氨基酸N-羧酸酐(NCA)的消旋及其與芐胺的反應[2]
注:4-EM4-乙基嗎啉;4-ChxM4-環己基嗎啉

在另外一篇報道中,Carpino等人發現在多肽片段偶聯時,也有類似的結果——2,4,6-三甲基吡啶(TMP,Collidine)產生的消旋產物最少(Table 3[3a]!在該反應中一個二肽Z-Phe-Val-OH與丙氨酸甲酯鹽酸鹽(H-Ala-OMe.HCl)的縮合,不管用哪個縮合劑,TMP的消旋總是最少的。

Table 3 Z-Phe-Val-Ala-OMe肽片段合成(2+1)的消旋情況[3a]

注:PS質子海綿;縮合劑的具體結構參見Table 7。
2)添加劑因素
Figure 2 苯并三氮唑類添加劑在縮合反應中的作用

在多肽合成中,加入添加劑是一種常見方法,可以提高收率,減少消旋的副反應——尤其在使用碳二亞胺類型的縮合劑,例如DIC時候,加入添加劑顯得尤為重要。目前,常用添加劑主要是一些苯并三氮唑類化合物(HOXt),主要包括:HOBt[4]、HOAt[5]6-Cl-HOBt[6]Figure 2)。這類苯并三氮唑化合物具有較強的酸性(pKa for HOBt: 4.60, pKa for HOAt: 3.28, pKafor 6-Cl-HOBt: 3.35[7],它們能夠與羧酸形成活性中間體。我們知道與碳二亞胺類縮合劑也可以和羧酸形成的活性中間體——O-酰異脲化合物。但是和O-酰異脲化合物相比,苯并三氮唑與羧酸形成的活性中間體更加穩定,可以避免O-酰異脲化合物重排N-酰異脲化合物從而失去反應活性(Figure 2[8]。在上述三個添加劑中,HOBt活性最差,消旋副反應通常是也最多的。HOAt活性最好,消旋的副反應也最少。HOAt吡啶環上7位氮原子發生的鄰位參與效應是其高活性關鍵因素(Figure 3)。但不幸的是,HOAt價格也是最昂貴的。6-Cl-HOBt的活性比HOBt略好,生產成本比HOAt稍低,是這三個里面“性價比”最均衡。雖然苯并三氮唑類添加劑是目前最常用的,但是研究發現苯并三氮唑類化合物具有易爆炸的風險[9]。目前這類化合物已被歸為I類爆炸品,其生產、運輸和使用都具有較高的風險。

 

Figure 3 HOAt的鄰位參與效應以及2-肟氰乙酸乙酯和1,3-二甲基紫丁酸的化學結構 

近年來,一些含肟的新型添加劑被Albericio小組開發出來,成功地應用于肽鍵的合成。最重要的兩個添加劑是:2-肟氰乙酸乙酯(OxymaPure[10]1,3-二甲基紫丁酸(Oxyma-B[11]。在與碳二亞胺類縮合劑DIC聯用的時候,2-肟氰乙酸乙酯和1,3-二甲基紫丁酸的縮合產率與HOAt相當,但是消旋的副反應更少(Table 4[11]。在更有挑戰性的肽片段[2+1]縮合反應中,2-肟氰乙酸乙酯和1,3-二甲基紫丁酸也表現出優于HOBt的抑制消旋化的效果(Table 5[11]。在進一步驗證消旋化的實驗中,Albericio等人利用固相合成制備幾個三肽化合物。這幾個三肽含有一些特別容易發生消旋化的氨基酸——絲氨酸(Ser),半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)。研究發現1,3-二甲基紫丁酸(Oxyma-B)對于抑制消旋的效果最好,甚至優于HOAt2-肟氰乙酸乙酯(OxymaPure)(Table 6[11]。 

Table 4Z-Phg-Pro-NH2的合成(固相合成)[11]
Table 5 二肽Z-Phe-Val-OHH-Pro-NH2的縮合(溶液相合成)[11]
Table 6 對三肽H-Gly-AA-Phe-NH2AA = Ser、Cys、CysAcm)或His)固相合成中的消旋研究[11]

3)縮合劑的因素

縮合試劑結構多變、種類繁多,琳瑯滿目,主要包括以下幾類:碳二亞胺類、銨鹽類、磷鹽類、吡啶鹽類、喹啉類、磷酸酯類等。本文前面介紹的幾種添加劑(HOXt、OxymaPure、Oxyma-B)都可以與一些銨鹽類或磷鹽結合,成為獨立的縮合劑。由于縮合試劑種類繁多,我們把一部分常見的和本文涉及到的縮合劑整理在Table 7里面。 

Table 7 常見的縮合劑——縮寫、結構、CAS號碼與相對價格

類型
縮寫
結構
CAS
相對價格

 

 

碳二亞胺類
DCC
538-75-0
DIC
693-13-0
EDC
25952-53-8

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

銨鹽類
HATU
148893-10-1
HBTU
94790-37-1
較高
TATU
873798-09-5
TBTU
125700-67-6
較高
HAPyU
151679-96-8
HBPyU
105379-24-6
較高
HAMDU
 
154561-27-0
HBMDU
 

HDMA
958029-37-3
HOTU
333717-40-1
較高
COMU
1075198-30-9
TFFH
164298-23-1
較高

 

 

 

 

 

 

 

膦鹽類
PyBOP
128625-52-5
較高
PyAOP
156311-83-0
PyBrOP
132705-51-2
較高
AOP
156311-85-2
PyOxim


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